杂草是危害作物产量的重要因素之一。微生物中耐受草甘膦的EPSP合成酶(EPSPS)基因aroA广泛应用于农作物抗除草剂的培育。自1996年全球第一次大面积种植转基因抗除草剂作物后，十多年来得到快速发展。但目前真正商业化应用于培育抗除草剂作物的基因，只有国际巨头孟山都公司克隆的源自农杆菌的CP4-EPSP合成酶基因等极少数基因。如何打破跨国公司在抗除草剂作物产业上的垄断成为紧迫的使命。 本项目主要内容包括：抗草甘膦除草剂微生物筛选；建立草甘膦靶酶EPSP合成酶基因aroA规模化分离技术；完成筛选获得的aroA基因原核表达、纯化以及酶学动力学研究，计算并比较不同来源EPSPS对底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸（S3P）的米氏常数、草甘膦抑制常数等酶动力学参数，为遴选适于应用的aroA基因奠定基础；开展aroA基因化学合成、结构优化和体外定向分子进化研究，通过创新的突变基因文库构建和体外定向分子进化方法，筛选一批酶比活提高和草甘膦耐受性增强的aroA突变基因；结合基因体外定向进化结果、蛋白质二级和三级结构，利用多位点突变技术，探索与酶活力、底物亲和力和草甘膦抗性密切相关的新位点，为aroA的基因改造研究提供新线索；完成aroA基因的植物遗传转化和功能研究，通过获得的转基因植物验证新型aroA基因对草甘膦除草剂耐受性。本项目涉及的学科包括分子生物学、生物化学、基因工程、植物生理学、微生物学和酶工程等。 与目前国内外同类研究综合比较，本项目在aroA基因分离、定向进化和功能研究上都具独创性，总体研究水平处于国际先进。项目的关键发明创新点包括：1）建立了简单高效适合规模化分离aroA基因的技术体系；2）利用相关技术体系首次从极端微生物中筛选到一种编码EPSPS对草甘膦极不敏感，与CP4 EPSPS同源性只有35%，且对底物亲和能力和Kcat/Km比CP4 EPSPS提高了13倍和29倍的新型aroA基因，是目前发现最优的EPSPS；3）首次从人苍白杆菌中克隆到底物亲和性很高的II型aroA基因，阐明了EPSPS参与底物结合和草甘膦抗性的关键位点；4）首次从植物病原拮抗微生物分离到对草甘膦敏感性较低的I型EPSPS的aroA基因，发现多个与草甘膦敏感和底物亲和密切相关的区域，利用模块替换，发现EPSPS对草甘膦敏感性区域和底物亲和性区域差异；5）建立了高效的aroA基因体外定向改组技术。该方法库容量大、突变频率高、突变位点可靠，利用基因体外改组获得Kcat/Km和Ki/Km比CP4-EPSPS提高6.3倍和1.7倍的新型aroA基因。 项目共发表SCI论文7篇，其中2篇为国际环境微生物顶级学术期刊，1篇为国际应用微生物核心期刊，引起了国内外同行专家高度关注；项目获得4项授权专利；项目发明专利核心技术在一些重要抗原抗体蛋白的表达中体现多个优点，为使用的公司创造了很好的经济效益，2011-2013年间新增产值1052万元，新增利润420万元。本项目建立的aroA基因规模化筛选体系已广泛应用于挖掘新型aroA基因。全球每年推广转CP4EPSP基因抗草甘膦作物面积在1亿hm2以上，可见获得的新型aroA基因未来潜在的商业价值。该项目对推动抗除草剂农作物新品种的培育具有重大意义。